多(duo)功(gong)能酶標(biao)儀(yi)中(zhong)熒(ying)光(guang)檢(jian)測(ce)技(ji)術(shu)介紹(shao)

由於發光物(wu)質不(bu)同熒(ying)光(guang)有(you)分子(zi)熒(ying)光(guang)和原(yuan)子(zi)熒(ying)光(guang)之分，分子熒(ying)光(guang)為帶光譜(pu)，原(yuan)子(zi)熒(ying)光(guang)為線光譜，通常所(suo)說的熒(ying)光(guang)為分子熒(ying)光(guang)。通(tong)過(guo)測(ce)定所(suo)發射(she)熒(ying)光(guang)的特性和強度(du)，可以(yi)對(dui)物(wu)質進行定性、定量分析。

熒(ying)光(guang)強(qiang)度(du)與熒(ying)光(guang)物(wu)質的濃(nong)度成正(zheng)比(bi)，這是熒(ying)光(guang)分(fen)析法(fa)是量分析的依據。在生物(wu)學上(shang)的應(ying)用非(fei)常廣泛，可以進行生(sheng)物(wu)大分(fen)子(zi)定量，酶活性分析，熒(ying)光(guang)免疫分析，細(xi)胞學分(fen)析（細(xi)胞增殖，細(xi)胞毒(du)理，細胞吸(xi)附(fu)等(deng)）和分子(zi)間相(xiang)互(hu)作(zuo)用。

Caspase家(jia)族在介導(dao)細(xi)胞雕亡(wang)的過(guo)程(cheng)中起(qi)著(zhe)非常重(zhong)要(yao)的作(zuo)用，其中Caspase-3為關鍵的執(zhi)行分(fen)子，它在雕亡(wang) 信(xin)號(hao)傳(chuan)導(dao)的許(xu)多途徑中(zhong)發揮功(gong)能。Caspase-3正(zheng)常以(yi)酶原(yuan)（32KD）的形式存(cun)在於胞漿中(zhong)，在雕亡(wang)的早期(qi)階段(duan)，它被(bei)激(ji)活(huo)，活(huo)化的Caspase-3由(you) 兩個(ge)大亞基（17KD）和兩個(ge)小(xiao) 亞基（12KD）組成，裂(lie)解相(xiang)應(ying)的胞漿胞核底(di)物(wu)，zui終導(dao)致(zhi)細(xi)胞雕亡(wang)。但(dan)在細胞雕亡(wang)的晚期(qi)和死亡(wang)細胞，caspase-3的活(huo)性明顯(xian)下(xia)降(jiang)。

體(ti)外(wai)細(xi)胞毒(du)性研究(jiu)對(dui)於檢(jian)測(ce)新的生(sheng)物(wu)來源或(huo)人(ren)工(gong)合(he)成的細(xi)胞毒(du)素以及例行的臨床(chuang)相(xiang)關的檢(jian)測(ce)都(dou)有(you)著(zhe)重(zhong)要(yao)的意(yi)義(yi)。細胞膜(mo)非(fei)滲(shen)透性的核(he)染(ran)料 Propidium iodide能穿(chuan)透(tou)損(sun)傷(shang)的細(xi)胞膜(mo)，熒(ying)光(guang)密(mi)度(du)越高(gao)反映(ying)出(chu)其受(shou)損(sun)細(xi)胞越多(duo)。

Fura-2、indo-1、Quin-2是Ca²⁺熒(ying)光(guang)指(zhi)示(shi)劑，可以靈敏地反映(ying)細(xi)胞內鈣離(li)子(zi)濃(nong)度的變(bian)化(hua)，當(dang)結(jie)合(he)鈣離(li)子(zi)時，zui大(da)激(ji)發波(bo)長會發生改變(bian)，發射(she)熒(ying)光(guang)的強(qiang)度和結合(he)的Ca²⁺濃(nong)度有(you)著(zhe)定量的關(guan)系。

1926年Perrin首(shou)先描述(shu)了熒(ying)光(guang)偏(pian)振(zhen)理(li)論，溶(rong)液(ye)中(zhong)的熒(ying)光(guang)分(fen)子(zi)在受(shou)到(dao)偏振(zhen)光(guang)照射(she)時，可(ke)吸(xi)收並(bing)釋(shi)放出(chu)相(xiang)應(ying)的偏(pian)振(zhen)熒(ying)光(guang)，如(ru)果在激發時熒(ying)光(guang)物(wu)質處 於靜止(zhi)狀態，發射(she)光(guang)將(jiang)保(bao)持(chi)原(yuan)有(you)激發光的偏(pian)振(zhen)性，如(ru)果其處於運(yun)動(dong)狀態，發射(she)光(guang)電(dian)偏振(zhen)偏(pian)振(zhen)平(ping)面將(jiang)不(bu)同於原(yuan)有(you)激發光的偏(pian)振(zhen)特性，這就是熒(ying)光(guang)偏(pian)振(zhen)現(xian)象，熒(ying)光(guang)分(fen)子(zi)與 其它因子(zi)的相(xiang)互(hu)作(zuo)用，例(li)如(ru)相(xiang)互(hu)結合(he)或(huo)排(pai)斥(chi)；其所處環(huan)境的性質，例(li)如(ru)溶(rong)液(ye)的粘(zhan)度、溫(wen)度等(deng)，這些因素(su)都有(you)可能對(dui)這個(ge)熒(ying)光(guang)因子(zi)受(shou)激發後(hou)發出的發射(she)光(guang)的發射(she)平(ping)面產 生影(ying)響(xiang)。因此(ci)以熒(ying)光(guang)偏(pian)振(zhen)為基礎發展(zhan)的技(ji)術可用來研究生(sheng)命科(ke)學(xue)中(zhong)分(fen)子之間的相(xiang)互(hu)作(zuo)用，如(ru)受(shou)體(ti)配體(ti)結(jie)合(he)分(fen)析，DNA－蛋白質結(jie)合(he)分(fen)析，SNP分(fen)析，酶活性分 析。

熒(ying)光(guang)偏(pian)振(zhen)分(fen)析所(suo)需的樣(yang)品量少，靈敏度(du)高(gao)，可(ke)達亞納摩爾級(ji)範圍，重(zhong)復(fu)性好，操(cao)作(zuo)簡便(bian)，也更為安全可靠，不會在實驗(yan)過(guo)程(cheng)中生(sheng)成有(you)害的放(fang)射(she)性廢(fei)物(wu)，此外(wai)熒(ying)光(guang)偏(pian)振(zhen)是真(zhen)正(zheng)均相(xiang)的，允(yun)許實時檢(jian)測(ce)（動(dong)力(li)學檢測(ce)），對(dui)於濃(nong)度變(bian)化(hua)不敏感(gan)，是均(jun)相(xiang)檢測(ce)形式（中間(jian)不含(han)洗(xi)滌(di)步(bu)驟(zhou)）的*解決方案(an)。

目前(qian)市(shi)場上(shang)多款(kuan)酶標(biao)儀(yi)都(dou)可以用來做熒(ying)光(guang)偏(pian)振(zhen)檢(jian)測(ce)，Invitrogene公(gong)司(si)專門(men)利用(yong)Predictor™ hERG對(dui)多(duo)款酶標(biao)儀(yi)進行熒(ying)光(guang)偏(pian)振(zhen)測(ce)試(shi)分(fen)析（表1）。

 

在做熒(ying)光(guang)測(ce)定的時候，由(you)於背(bei)景(jing)熒(ying)光(guang)信(xin)號(hao)幹(gan)擾，使用(yong)傳(chuan)統(tong)的發色團(tuan)進而進行熒(ying)光(guang)檢(jian)測(ce)的靈敏度(du)就會嚴(yan)重(zhong)下(xia)降(jiang)。大(da)部(bu)分背(bei)景(jing)熒(ying)光(guang)信(xin)號(hao)是短(duan)時存(cun)在的，因此(ci)使用(yong)長(chang)衰減壽(shou)命(ming)的標(biao)記(ji)物(wu)就可以使瞬時熒(ying)光(guang)幹(gan)擾減到(dao)zui小(xiao)化(hua)。

時間(jian)分(fen)辨熒(ying)光(guang)是用(yong)稀(xi)土(tu)元素(su)作(zuo)為標(biao)記(ji)物(wu)，稀(xi)土(tu)三價(jia)離(li)子(zi)的電(dian)子雲的結(jie)構(gou)會壹定程(cheng)度上(shang)限制(zhi)了(le)電(dian)子的遷(qian)移，導(dao)致(zhi)這類元素(su)發生 的熒(ying)光(guang)的衰(shuai)減周(zhou)期(qi)通常是很長(chang)的，從(cong)而消除背(bei)景(jing)熒(ying)光(guang)的幹(gan)擾 大大(da)提(ti)高(gao)檢(jian)測(ce)的靈敏度(du)（表2）。應(ying)用稀(xi)土(tu)元素(su)作(zuo)標(biao)記(ji)物(wu)的另(ling)壹個(ge)好處是激(ji)發光與發射(she)光(guang)峰(feng)值(zhi)Stoke 位(wei)移大(da)。這就可消除激(ji)發光和散射(she)光(guang)的幹(gan)擾，同時, 被(bei)激(ji)發的熒(ying)光(guang)光(guang)帶極窄(zhai), 熒(ying)光(guang)的發射(she)峰(feng)非(fei)常尖(jian)銳, 可(ke)使儀(yi)器(qi)調(tiao)整(zheng)在極窄(zhai)的波(bo)長範圍內(nei)測(ce)定, 極(ji)大地降(jiang)低(di)了來自(zi)背(bei)景(jing)的各(ge)種幹(gan)擾。

表2.常見熒(ying)光(guang)團(tuan)隊(dui)熒(ying)光(guang)壽(shou)命(ming)

時間(jian)分(fen)辨熒(ying)光(guang)靈敏度(du)高(gao)、特異(yi)性強、穩定性好、標(biao)記(ji)物(wu)制備(bei)簡(jian)便(bian)、檢(jian)測(ce)重(zhong)復(fu)性好、操(cao)作(zuo)流程(cheng)短，適用(yong)於生(sheng)物(wu)學、醫(yi)學(xue)上(shang)的超微(wei)量分析，像(xiang)激(ji)素檢(jian)測(ce)，病(bing)毒(du)性肝炎(yan)標(biao)誌物(wu)檢測(ce)，靶向細(xi)胞的標(biao)記(ji)檢測(ce)以(yi)及藥物(wu)篩選等(deng)方面。

熒(ying)光(guang)共(gong)振(zhen)能量傳(chuan)遞現(xian)象(xiang)是Perrin在20世(shi)紀(ji)初首(shou)先發現的，1948年，Foster創立(li)了(le)理論(lun)原(yuan)理(li)，指(zhi)熒(ying)光(guang)能量供(gong)體(ti)與(yu)受(shou)體(ti)間(jian)通(tong)過(guo)偶(ou)極(ji)－偶(ou)極(ji) 耦(ou)合(he)作(zuo)用轉(zhuan)移能量的過(guo)程(cheng)，這種能量的轉(zhuan)移是非(fei)放射(she)性的，產生FRET的條(tiao)件主要(yao)有(you)三個(ge)：（1）供(gong)體(ti)與(yu)受(shou)體(ti)間(jian)足(zu)夠靠近（1～10 nm）；（2）供(gong)體(ti)的發射(she)光(guang)譜(pu)與受(shou)體(ti)的激(ji)發光譜有(you)壹定的重(zhong)疊(die)；（3）給體(ti)與(yu)受(shou)體(ti)的偶(ou)壹(yi)定的空(kong)間取向，這是偶(ou)極(ji)－偶(ou)極(ji)耦(ou)合(he)作(zuo)用的條(tiao)件。

熒(ying)光(guang)共(gong)振(zhen)能量傳(chuan)遞因為要(yao)考慮(lv)到(dao)供(gong)體(ti)和受(shou)體(ti)之間的距(ju)離(li)，所(suo)以(yi)經常用(yong)來研究分(fen)子間的相(xiang)互(hu)作(zuo)用，像(xiang)蛋白質的相(xiang)互(hu)作(zuo)用，抗(kang)原(yuan)抗(kang)體(ti)結(jie)合(he)，受(shou)體(ti)與(yu)配體(ti)的結(jie) 合(he)，另(ling)外(wai)在膜(mo)反應(ying)、離(li)子(zi)通(tong)道(dao)等(deng)方面的研(yan)究也有(you)相(xiang)應(ying)應(ying)用。將(jiang)FRET熒(ying)光(guang)探(tan)針(zhen)標(biao)記(ji)的肽(tai)鏈，加(jia)入(ru)到(dao)固(gu)體(ti)表面的雙(shuang)層(ceng)膜(mo)中(zhong)，通(tong)過(guo)熒(ying)光(guang)漂(piao)白(bai)恢(hui)復(fu)（FRAP）成像(xiang)技(ji)術(shu) 檢測(ce)，為研究跨膜(mo)螺旋(xuan)二(er)聚作(zuo)用提(ti)供(gong)壹個(ge)新的方法(fa)。用(yong)FRET標(biao)記(ji)細胞質，應(ying)用時間(jian)分(fen)辨技術，檢測(ce)其對(dui)P2X離(li)子(zi)通(tong)道(dao)的門(men)控(kong)作(zuo)用。

利用(yong)Eu等(deng)長效熒(ying)光(guang)物(wu)質作(zuo)為供(gong)體(ti)，來進行熒(ying)光(guang)共(gong)振(zhen)能量傳(chuan)遞，在激發光熄滅(mie)後(hou)受(shou)體(ti)仍(reng)能較(jiao)長的能量衰減時間(jian)，能量傳(chuan)遞效率(lv)更高(gao)，可(ke)檢測(ce)的相(xiang)互(hu)作(zuo)用距(ju)離(li)更長(chang)，可(ke)達到(dao)100-200nm，時間(jian)延遲(chi)檢測(ce)，降(jiang)低(di)了背(bei)景(jing)噪音(yin)，提(ti)高(gao)了(le)靈敏度(du)

熒(ying)光(guang)法(fa)靈敏、準(zhun)確、兼容(rong)性強、可(ke)以(yi)利用(yong)熒(ying)光(guang)分(fen)子(zi)對(dui)目(mu)標(biao)物(wu)質進行特異(yi)性標(biao)記(ji)大大(da)減少(shao)雜(za)質的信(xin)號(hao)幹(gan)擾，熒(ying)光(guang)特性參(can)數多(duo)，動(dong)態線性範圍寬、可以活(huo)細胞 活活(huo)體(ti)檢(jian)測(ce)，靈敏度(du)比(bi)分光(guang)光(guang)度(du)法(fa)高(gao)2～4個(ge)數量級(ji)，對(dui)微(wei)量和痕量藥物(wu)進行靈敏準(zhun)確的檢(jian)測(ce)具(ju)有(you)較大(da)的*性。總之熒(ying)光(guang)法(fa)作(zuo)為壹種高(gao)靈敏的分(fen)析手段(duan)，與其它技(ji) 術(shu)相(xiang)結合(he)，有(you)著(zhe)更廣闊的發展(zhan)前(qian)景(jing)。