高速離(li)心機的離(li)心分離(li)方(fang)法(fa)

制備(bei)型(xing)超(chao)高速離(li)心機的幾種(zhong)分(fen)離(li)方(fang)法(fa)：

A．差速離(li)心：逐(zhu)次增(zeng)加離(li)心力，每次可(ke)沈降樣品(pin)溶(rong)液(ye)中(zhong)的壹(yi)些組份。

差速離(li)心是壹(yi)種(zhong)zui常用(yong)的(de)方(fang)法(fa)。在(zai)這種方(fang)法(fa)中(zhong)，離(li)心管在開始(shi)時裝(zhuang)滿了均(jun)壹的樣品(pin)溶(rong)液(ye)。通過在(zai)壹(yi)定速度下壹定時間(jian)的(de)離(li)心後，就可得到兩個(ge)部(bu)份：沈澱(dian)和上(shang)清(qing)液(ye)。

通常在(zai)*次離(li)心時把(ba)大部(bu)分不(bu)需(xu)要的(de)大粒(li)子(zi)沈降去掉(diao)。這(zhe)時所(suo)需(xu)的(de)組(zu)份(fen)大部(bu)分仍(reng)留(liu)在(zai)上清(qing)液(ye)中(zhong)。然(ran)後(hou)將(jiang)收(shou)集到的上(shang)清(qing)液(ye)以(yi)更高速度離(li)心，把(ba)所(suo)需(xu)的(de)粒(li)子(zi)沈積下來。離(li)心的時間(jian)要選擇得當，使(shi)大部(bu)份不(bu)需(xu)要的(de)更(geng)小的(de)粒(li)子(zi)仍(reng)留(liu)在(zai)上清(qing)液(ye)中(zhong)。對於(yu)得到的沈澱(dian)和上(shang)清(qing)液(ye)可以(yi)進(jin)行進(jin)壹(yi)步(bu)的(de)離(li)心，直到達到所(suo)需(xu)要的(de)分(fen)離(li)純度為止。

差速離(li)心的特點(dian)是操(cao)作(zuo)簡(jian)單，但分(fen)離(li)純度不高。

B．密(mi)度梯(ti)度離(li)心法(fa)：可(ke)以(yi)同時使(shi)樣品(pin)中(zhong)幾個(ge)或(huo)全部(bu)組份(fen)分(fen)離(li)，具有(you)很好的分(fen)辨率。

(1)速率區(qu)帶(dai)法(fa)(ratezonal)：

根(gen)據樣品(pin)中(zhong)不同(tong)粒(li)子(zi)所(suo)具有(you)的(de)不(bu)同(tong)的尺(chi)寸大小及(ji)沈降速度(S)。大致步(bu)驟(zhou)如(ru)下：

在離(li)心管中(zhong)裝入(ru)密(mi)度梯(ti)度溶液(ye)，溶液(ye)的密(mi)度從離(li)心管頂部(bu)至底(di)部(bu)逐(zhu)漸增(zeng)加(正(zheng)梯(ti)度)。

將(jiang)所(suo)需(xu)分(fen)離(li)的樣品(pin)小(xiao)心地(di)加至密(mi)度梯(ti)度溶液(ye)的頂部(bu)。樣品(pin)在(zai)梯(ti)度溶液(ye)表(biao)面(mian)形成壹負梯(ti)度。

由(you)於不同(tong)大小的粒(li)子(zi)在(zai)離(li)心力作用下，在梯(ti)度中(zhong)移動(dong)的速度不壹(yi)樣，所(suo)以(yi)經過離(li)心後會形成幾條(tiao)分(fen)開(kai)的(de)樣品(pin)區(qu)帶(dai)。

註(zhu)意(yi)：樣品(pin)粒(li)子(zi)的(de)密(mi)度必須大於梯(ti)度液(ye)註(zhu)中(zhong)任(ren)壹(yi)點(dian)的密(mi)度。離(li)心過程(cheng)必(bi)須在區(qu)帶(dai)到達管(guan)子(zi)底(di)部(bu)前停(ting)止。

(2)等密(mi)度離(li)心法(fa)(isopycnic)：

根(gen)據粒(li)子(zi)的(de)不(bu)同(tong)密(mi)度來分(fen)離(li)。離(li)心過程(cheng)中(zhong)，粒(li)子(zi)會(hui)移(yi)至與(yu)它(ta)本身(shen)密(mi)度相(xiang)同(tong)的地(di)方(fang)形成區(qu)帶(dai)。

密(mi)度樣度的選擇要使(shi)梯(ti)度的範(fan)圍包括所(suo)有(you)待分離(li)粒(li)子(zi)的(de)密(mi)度。樣品(pin)可(ke)以(yi)在密(mi)度梯(ti)度液(ye)粒(li)上面(mian)或均(jun)勻分布(bu)在(zai)密(mi)度梯(ti)度中(zhong)。經離(li)心後，樣品(pin)粒(li)子(zi)達(da)到它(ta)們的(de)平衡點(dian)。

註(zhu)意(yi)：平衡後粒(li)子(zi)的(de)分(fen)離(li)*由(you)其密(mi)度決定，與時間(jian)無(wu)關(guan)，此時再改(gai)變(bian)離(li)心轉速，只(zhi)能改(gai)變(bian)區(qu)帶(dai)的相(xiang)對(dui)位置(zhi)。

密(mi)度梯(ti)度分析法(fa)

(1)梯(ti)度介(jie)質性(xing)質與(yu)選擇：

A、應(ying)具(ju)備的(de)性質：

梯(ti)度物質的(de)選擇原(yuan)則是滿足分離(li)方(fang)法(fa)的(de)基本要求(qiu)，壹(yi)個理想的密(mi)度材料標準(zhun)它(ta)應是：

所(suo)形成的溶液(ye)密(mi)度應包(bao)括所(suo)需(xu)要的(de)密(mi)度範(fan)圍。

具有(you)某些(xie)性質，如(ru)折射(she)率，據此可(ke)測定它(ta)的濃(nong)度。

所(suo)形成的溶液(ye)粘度低。

不(bu)損傷(shang)所(suo)分離(li)的樣品(pin)。

離(li)心分離(li)後容(rong)易(yi)除(chu)去(qu)。

不(bu)妨(fang)礙(ai)分(fen)離(li)積分的分析。

B、常用(yong)介(jie)質種(zhong)類：

表(biao)壹(yi)、常用(yong)梯(ti)度材料在(zai)20℃密(mi)度

B．梯(ti)度介(jie)質應(ying)用範(fan)圍：

表(biao)二(er)、等(deng)密(mi)度梯(ti)度介(jie)質的(de)應用

表(biao)三(san)、各(ge)種大分子(zi)在(zai)蔗(zhe)糖(tang)梯(ti)度液(ye)中(zhong)的大約密(mi)度

(2)、梯(ti)度溶液(ye)的準備(bei)：

計(ji)算,稀釋

(3)梯(ti)度形狀(zhuang)

梯(ti)度形狀(zhuang)分(fen)：線型(xing)、等(deng)速型(xing)、階梯(ti)型(xing)、平坦型(xing)、陡(dou)峭型(xing)指(zhi)數(shu)梯(ti)度。

梯(ti)度形狀(zhuang)對(dui)於分(fen)離(li)是否成功非(fei)常重(zhong)要：

zui常用(yong)的(de)是線型(xing)梯(ti)度，適用於分離(li)蛋白質、酶(mei)、激素、核糖(tang)體亞基和壹(yi)些植(zhi)物病(bing)毒；等(deng)速(su)型(xing)適用於分離(li)脂(zhi)蛋(dan)白(bai)和壹(yi)些需(xu)上(shang)浮分離(li)樣品(pin)；不(bu)連續或階梯(ti)型(xing)梯(ti)度zui適用於分離(li)整(zheng)細胞、亞細胞組分(fen)以(yi)及(ji)純化壹(yi)些哺乳(ru)類動物病(bing)毒或(huo)昆蟲病(bing)毒。等(deng)速(su)梯(ti)度以(yi)及(ji)長(chang)液(ye)柱(zhu)可(ke)增(zeng)進(jin)分(fen)離(li)能力，適用於分離(li)核糖(tang)體亞基、多核糖(tang)體及(ji)植(zhi)物病(bing)毒。

B．梯(ti)度柱(zhu)制備(bei)：

梯(ti)度液(ye)柱(zhu)可(ke)以(yi)用手(shou)工或(huo)梯(ti)度儀制備(bei)

半註(zhu)法(fa)：

為縮(suo)減離(li)心時間(jian)，或(huo)分(fen)離(li)樣品(pin)較少(shao)可用(yong)半註(zhu)法(fa)：下半管鋪(pu)置(zhi)梯(ti)度介(jie)質，中(zhong)間加樣品(pin)，上(shang)面鋪(pu)Buffer或液(ye)體石臘油(you)。

(4)加樣方(fang)法(fa)與(yu)加樣量：

將(jiang)樣品(pin)加到梯(ti)度液(ye)柱(zhu)上(shang)，針尖和離(li)心管成45-60°角(jiao)度，慢慢地(di)將(jiang)樣品(pin)沿管(guan)壁流到液(ye)面上去(qu)，對(dui)於DNA壹類(lei)易(yi)斷(duan)的(de)脆弱(ruo)樣品(pin)，應(ying)該(gai)用(yong)孔(kong)徑較大的移液(ye)管代替(ti)針頭(tou)，以(yi)避免(mian)剪(jian)切力對樣品(pin)的(de)切割(ge)作用。樣品(pin)濃(nong)度是梯(ti)度柱(zhu)zui小(xiao)密(mi)度的1/10(W/W)。

(5)轉(zhuan)子(zi)的(de)選擇與(yu)效(xiao)應：

(6)分(fen)離(li)區(qu)帶(dai)的回(hui)收(shou)及(ji)檢測

離(li)心後所(suo)形成的區(qu)帶(dai)樣品(pin)的(de)回(hui)收(shou)方(fang)法(fa)基本有(you)四(si)種(zhong)：

a.穿(chuan)刺(ci)法(fa)

穿(chuan)刺(ci)離(li)心管底(di)部(bu)，使梯(ti)度溶液(ye)滴(di)出，將(jiang)壹(yi)具有(you)合(he)適閥門的蓋帽(mao)放在離(li)心管頂，可控(kong)制滴(di)出速(su)度。

b.虹(hong)吸(xi)法(fa)：

將(jiang)壹(yi)毛細管輕輕插(cha)入(ru)管(guan)底(di)，盡量防(fang)止梯(ti)度抖(dou)動(dong)，用(yong)微(wei)量泵(beng)逐(zhu)漸滴(di)取(qu)，以(yi)壹定量滴(di)數(shu)或體積部(bu)分收(shou)取(qu)。

c.加壓法(fa)：

通(tong)過壹針管(guan)將(jiang)高密(mi)度的液(ye)體泵入(ru)到梯(ti)度離(li)心管的底(di)部(bu)，部(bu)分收(shou)集(ji)換出的(de)溶(rong)液(ye)。

d.切割(ge)法(fa)：

采(cai)用(yong)的(de)切割(ge)刀切割(ge)所(suo)需(xu)區(qu)帶(dai)。

區(qu)帶(dai)檢測：

所(suo)謂區(qu)帶(dai)檢測，實際(ji)上(shang)是對(dui)水平轉子(zi)或(huo)角(jiao)轉子(zi)和垂(chui)直轉(zhuan)子(zi)離(li)心管中(zhong)的分(fen)離(li)物質所(suo)做的(de)監(jian)測，通常只(zhi)是測量在(zai)260或(huo)280mm時長(chang)的(de)吸(xi)收值(zhi)，以(yi)決定梯(ti)度中(zhong)的核酸或蛋(dan)白(bai)的(de)整(zheng)個(ge)分(fen)布(bu)，這(zhe)個操(cao)作(zuo)通(tong)常稱之(zhi)為在(zai)線(online)監測。